(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111638460.3 (22)申请日 2021.12.2 9 (71)申请人 镇江市中西医结合医院 （镇江市第 二人民医院） 地址 212000 江苏省镇江市团山路18号 (72)发明人 胡萍萍　陈谦　宗斌　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 黄雪兰 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/12(2006.01) A61K 9/50(2006.01) A61K 47/46(2006.01)A61K 31/59(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 31/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制 备方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种生物活性物质或药物传 递微囊泡的制备方法及其应用， 属于药物传递领 域， 本发明利用大剂量紫外辐射促使真核细胞脱 核， 以密度梯度离心收集去核体， 以超声使之微 囊泡化， 所制备的微囊泡可用于负载多种水溶性 及脂溶性生物活性物质或药物， 含不同成分或药 物的微囊泡可应用于组织损伤修复、 免疫调节、 感染控制及肿瘤治疗等方面， 本发 明具有制备过 程简单、 易于标准化、 原料来源丰富、 成本低廉等 优点； 所制备的负载生物活性 成分或药物的微囊 泡应用范围广泛， 本发明可用于生物活性成分或 者药物的体内外传递， 具有广阔的应用前 景。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 114395531 A 2022.04.26 CN 114395531 A 1.一种生物活性物质或药物传递 微囊泡的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤； 步骤一： 紫外辐射 促使真核细胞主动脱 核； 步骤二： Perco ll法分离纯化去 核体； 步骤三： 超声一 步法制备含细胞外分泌活性成分或药物的去 核微囊泡； 步骤四： 超滤法分离纯化载 药微囊泡。 2.根据权利要求1所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述步骤一中的脱 核程序包括： S1： 制备单细胞悬液， 培养真核细胞至对数生长期， 以磷酸缓冲液清洗三遍后， 胰酶消 化3‑5分钟获得 单细胞悬液； S2： 离心， 将S1中获得的单细胞悬液以无血清培养液清洗后离心， 重复3遍后将细胞沉 淀重悬于无 血清培养液中； S3： 脱核， 在离心完成后立即进行紫外辐射， 随后继续培养4 ‑6h， 细胞将出现自发脱核 现象， 并形成大量的去 核体。 3.根据权利要求2所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述S3中紫外辐射剂量 为1‑100×105μJoules/ cm2， 波长范围为20 0‑380nm。 4.根据权利要求2所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述步骤二中分离纯化 程序包括： A1： 以灭菌PBS稀释无菌Perco ll液体至40％， 获得密度为1.0 56g/ml的Perco ll分离液； A2： 使用A1中的Percoll分离液铺于离心管底部， 并将步骤S3中所获取的含去核体和核 体的培养液平铺于Perco ll液上方； A3： 以800 ‑2000g的离心力离心10 ‑30分钟， 吸取上层液体， 获得纯化的去核体， 以细胞 计数板对去 核体悬液进行计数， 计算浓度， 稀释至所需浓度， 以备 载药。 5.根据权利要求4所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述步骤三中制备 载细胞外分泌活性成分微囊泡的方法包括： B1： 利用基因工程手段促使细胞分泌生物活性成分； B2： 收集培养上清， 低 速离心过滤去除细胞碎片， 利用A 1‑A3的方法获取去核体， 将去核 体重悬于培养上清中， 以10 ‑900W的超声 能量一步完成去核体的微囊泡化和 外分泌活性成 分的负载； B3： 以超滤分离纯化负载外分泌活性成分的微囊泡。 6.根据权利要求5所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述生物活性成分包括分泌型生长因子、 炎症因子、 抑炎因子及其 他可分泌的因子 。 7.根据权利要求4所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述步骤三中制备 载药物的微囊泡的方法包括： C1： 将水溶性的生物活性物质或者药物溶于等渗液中， 按照所需配比， 加入一定量A3中 获取的去核体悬液， 混匀， 在冰水浴下， 以10 ‑900W的功率进行超声处理， 每次超声持续2 ‑5 秒， 间隔10秒， 进行多次循环， 最后收集液体以备 纯化； C2： 将脂溶性药物混匀于少量大豆油中， 随后将混合液滴加入一定量A3中获取的去核 体悬液， 混匀， 在冰水浴下， 以10 ‑900W的功率进行超声处理， 每次超声持续2 ‑5秒， 间隔10 秒， 进行多次循环， 最后收集液体以备 纯化。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114395531 A 28.根据权利要求7所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述C1中的等 渗液为生理盐水、 磷酸缓冲液以及其 他适用的液体。 9.根据权利要求7所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法， 其特征在 于： 所述步骤四中超滤分离纯化载药微囊泡的方法是将C1或者C2超声处理后的混悬液， 加 入100KDa的超滤 管中， 4000g离心30分钟， 并用PBS清洗三次， 收集浓 缩液， 进行包封率测定 。 10.一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法应用， 其特征在于： 包括使用权利 要求1‑9任意一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法所制得的微囊泡在组织损伤 修复、 免疫调节、 感染控制及肿瘤治疗方面的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114395531 A 3