(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111598162.6 (22)申请日 2021.12.24 (71)申请人 泉州师范学院 地址 362000 福建省泉州市丰泽区东海大 街398号 (72)发明人 段训威　肖桂清　杨槟煌　王礼兴　 陈怀宇　吴文林　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 彭琴　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12N 15/864(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/0784(2010.01)A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋 巴细胞的制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种肾癌抗原CA9蛋白特异性 细胞毒性T淋巴细胞的制备方法， 属于免疫细胞 治疗技术领域。 本发明的方法包括： 携带抑制免 疫负调控基因siSOCS1及CA9目的基因的rAAV2 ‑ siSOCS1‑CA9重组病毒载体的制备； 单个核细胞 中DC细胞的分离与培养； rAAV2 ‑siSOCS1‑CA9重 组病毒载体感染， 诱导DC细胞成熟， 得iAPA ‑CA9‑ DC细胞； iAPA ‑CA9‑DC细胞与T细胞混合培养， 获 得具有抗原特异性 的iAPA‑CA9‑DC/CTL细胞， 即 树突状细胞激活的肾癌蛋白CA9特异性细胞毒 性 T淋巴细胞。 本发明的方法培养扩增出大量肿瘤 抗原特异性T细胞， 以达 到治疗癌症的目的。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图2页 CN 114277056 A 2022.04.05 CN 114277056 A 1.肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： （1） 携带siSOCS1及CA 9目的基因的r AAV2‑siSOCS1‑CA9重组病毒载体的制备； （2） rAAV2 ‑siSOCS1‑CA9重组病毒载体感染、 分化、 诱导DC细胞成熟， 得iAPA ‑CA9‑DC细 胞； （3） iAPA ‑CA9‑DC细胞与T细胞混合培养， 获得iAPA ‑CA9‑DC/CTL细胞， 即肾癌抗原CA9蛋 白特异性细胞毒性T淋巴细胞。 2.根据权利要求1所述的培养方法， 其特征在于： 步骤 （1） 中所述携带目siSOCS1及CA9 的目的基因序列依次为： U6启动子序列、 SOCS1  siRNA序列、 SOCS1  siRNA反向序列、 CMV启动 子序列、 CA9蛋白基因序列、 IRES序列、 Flagellin鞭毛蛋白基因序列； 所述SOCS1  siRNA序列 如SEQ ID NO.1所示， SOCS1  siRNA反向序列如SEQ  ID NO.2所示， SOCS1  siRNA序列和SOCS1   siRNA反向序列， 两段序列 反向互补； 目的基因与2型腺相关病毒载体AAV2组装获得rAAV2 ‑ siSOCS1‑CA9重组病毒载体。 3.根据权利要求1所述 的方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中， 所述rAAV2 ‑siSOCS1‑CA9重组 病毒载体感染、 分化、 诱导DC细胞 成熟中， 按照MOI  100进行rAAV2 ‑siSOCS1‑CA9重组病毒载 体感染DC细胞。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中， iAPA ‑CA9‑DC细胞与T细 胞混合 培养的， 包括以下 具体步骤： 1） 加入刺激因子CD3单抗50 ng/ml， CD28单抗50 ng/mL， IL ‑2 1000 U/mL， 刺激T细胞增 殖； 2） T细胞刺激增殖培养48h后， iAPA ‑CA9‑DC细胞与T细胞按1:5的比例混合培养， 调整细 胞密度为1 ×106 cell/mL， 添加1000  U/mL IL2的KBM581培养基； 获得iAPA ‑CA9‑DC/CTL细 胞。 5.一种权利要求1所述方法制备的肾癌抗原CA 9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞。 6.一种包含权利要求5所述肾癌 抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的癌症治疗药 物。 7.权利要求5所述肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞在非疾病诊断、 治疗生 物领域的应用。 8.权利要求6所述包含肾癌 抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的癌症治疗药物在 非疾病诊断、 治疗生物领域的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114277056 A 2一种肾癌抗原CA9蛋白特异性 细胞毒性T淋巴细胞的制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于免疫细胞治疗技术领域， 具体涉及一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞 毒性T淋巴细胞的制备方法。 本发明的细胞毒性T淋巴细胞是由经携带免疫负调控基因 SOCS1基因及碳酸酐酶IX基因的rAAV2修饰的树突状细胞激活的， 具有CA9肿瘤抗原特异性， 可用于抗肾细胞癌的免疫细胞治疗。 背景技术 [0002]成人肾脏中最常见的占位性病变—肾细胞癌 （renal  cell carcinoma,  RCC） 约占 所有肿瘤2%， 且在全世界范围内每年以1.5 ‑5.9%增长。 部分患者首诊 时已是晚期或发生远 端转移， 且肾癌具有多重耐药基因对放疗、 化疗不敏感， 愈后较差， 中位生存时间<12个月， 5 年生存率<10%。 目前， 手术切除是最好的治疗方法， 但棘手的是， 微小和转移病灶难以手术 切除， 术后患者复发率高达20% ‑40%； 此外， 部分患者采用IL ‑2， IFN‑α 等细胞因子治疗有效， 但药物的毒性作用十分明显 。 [0003]RCC的发生、 发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关。 特别是RCC患者到了晚 期， 患者体液免疫与细胞免疫功能普遍低下， RCC细胞无法被T细胞识别、 杀伤。 由于荷瘤宿 主的树突状细胞 （dendritic  cell, DC） 数量少， 无法有效递呈RCC抗原， 且RCC细胞分泌 VEGF、 IL‑10、 TGF‑β、 PGE2等细胞因子和粘附分子， 使树突状细胞的成熟分化停留在幼稚阶 段或向其他内皮细胞转化， MHC ‑II类分子及某些共刺激分子的低表达， 从而使 得 DC严重降 低甚至失去其 抗原递呈及激活T细胞的能力。 [0004]目前体外实验证实， 分离患者外周血的淋巴细胞对多种外来抗原具有很好的反应 能力。 因此肿瘤过继性免疫细胞疗法 （D C/CTL） 有望成为较好的RCC治疗 方法， 其作用机制是 DC体外荷载RCC抗原， 并通过MHC/抗原肽 ‑TCR的相互作用激活特异性CTL， 回输机体启动抗 RCC免疫应答， 清除RCC。 目前常采用肿 瘤细胞裂解物负载DC， 但其有不足， 非肿瘤相关抗原 种类多， 易诱 发自身免疫病， 且多抗原亦导致免疫原 性低； 另一种刺激诱导物采用肿瘤抗原 肽致敏DC， 其特异性好， 可多 次免疫， 但也存在不足， 抗原肽价格一般较贵、 半衰期短， 需多 次免疫才能获得良好的CTL。 [0005]对于负载DC的研究日渐深入， 研究人员发现通过制备转基因DC并体外诱导CTL， 可 促进CTL充分发挥抗肿 瘤作用。 与肿 瘤全抗原、 抗原裂解物相比， 肿 瘤转基因制备的DC/CTL 特异性更好， 抗肿瘤免疫反应更强； 与肿瘤抗原肽相比， 肿瘤转基因可持续表达， 有效降低 DC/CTL制备成本。 目前rAAV因具有感染能力强、 安全性好、 免疫源性低和体内长时间表达外 源基因等特点， 被视为最有前途的基因转移载体之一， 在世界范围内的基因治疗和疫苗研 究中得到广泛应用。 基于DC的肿瘤细胞靶向治疗技术（anti ‑cancer cellular   immunotherapy,  ACTL） 是通过基因重组改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的rAAV 转导DC， 刺激产生特异性杀伤肿瘤细胞的CTL。 研究表 明， CTL反应能力方面， 带抗原的rAAV 优于蛋白质负荷， 其 转染DC效率高达90%以上， 且具有上调DC的功能。 [0006]肿瘤转基因制备DC/CTL方法安全且副作用少， 对微小和转移病 灶的RCC更有传统说　明　书 1/5 页 3 CN 114277056 A 3