(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111600934.5 (22)申请日 2021.12.24 (71)申请人 湖南中医药大学第一附属医院 （ （中 医临床研究所） ） 地址 410000 湖南省长 沙市韶山中路95号 (72)发明人 蔡蔚　蒋伟平　刘起立　贺潇　 毛璟弢　黄丽玲　谢晓　杨华伟　 龙蠡　谢海平　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 陈彦波 (51)Int.Cl. A61K 36/85(2006.01) A61P 13/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 29/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (54)发明名称 一种马归液在非可控性炎症中的用途及验 证方法 (57)摘要 本发明属于中医药技术领域， 公开了一种马 归液在非可控性炎症中的用途及验证方法， 所述 马归液在非可控性炎症中的用途， 包括马归液对 内毒素致膀 胱上皮细胞中HER2磷 酸化及HSP9 0表 达具有干 预作用； 所述验证马归 液对内毒素致膀 胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP9 0表达的干预作 用的方法包括： 细胞培养； 免疫荧光法检测CRL ‑ 9520 SV‑HUC‑1细胞p‑HER2； Western  Blotting 方法检测p ‑HER2在CRL ‑9520细胞中表 达； 统计学 分析。 结果表明， LPS刺激SV ‑HUC‑1细胞HER2磷 酸 化； 马归液能较好控制LPS致炎细胞HER2磷酸化， 通过降低致炎细胞内HSP90蛋白的表达抑制HER2 的磷酸化。 权利要求书3页 说明书11页 附图3页 CN 114432386 A 2022.05.06 CN 114432386 A 1.一种马归液在非可控性炎症中的用途， 其特征在于， 所述马归液在非可控性炎症中 的用途， 包括马归 液50mg/ml对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90表达具有干预 作用。 2.一种验证如权利要求1所述马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90 表达的干预作用的方法， 其特征在于， 所述验证马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷 酸化及HSP90表达的干预作用的方法包括以下步骤： 步骤一， 进行细胞培 养和实验细胞分组； 步骤二， 免疫荧 光法检测CRL ‑9520SV‑HUC‑1细胞p‑HER2； 步骤三， WesternBl otting方法检测p ‑HER2在CRL ‑9520细胞中表达； 步骤四， 统计学分析： 采用S PSS19.0软件 对结果进行 数据分析。 3.如权利要求2所述验证马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90表达 的干预作用的方法， 其特 征在于， 步骤一中， 所述细胞培 养， 包括： CRL‑9520SV‑HUC‑1细胞培养在含10％FBS、 100U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM/ F12完全培养基中， 保持37℃5％CO2不变； 细胞密度1 ×105个/ml接种在各规格培养板或培养 皿， 当细胞生长80％融合时， 按预实验结果， 选择小鼠抗人的EGF抗体50ng/ml， 母液10μg/ ml； 小鼠抗人TGFα 抗体5ng/ml， 母液5 μg/ml； 37℃， 30min后， 在培养基 中加LPS 10 μg/mL， 培 养96h。 4.如权利要求2所述验证马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90表达 的干预作用的方法， 其特 征在于， 步骤一中， 所述实验细胞分组， 包括： 正常细胞对照组； 加入等 量的培养液代替 LPS； LPS模型组： 加入所述 LPS溶液； 马归液组： 在加入LP S前加入5 0mg/ml的马归液； 抗内毒素抗体组： 于加入LP S前加入等 量的抗内毒素抗体； HSP90抑制剂组： 加入10ng/mL浓度的17 ‑AAG溶液后， 再加入LP S溶液。 5.如权利要求2所述验证马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90表达 的干预作用的方法， 其特征在于， 步骤二中， 所述免疫荧光法检测CRL ‑9520SV‑HUC‑1细胞p‑ HER2， 包括： (1)盖玻片清洗， 过酸过夜， 蒸馏水及去离子水清洗后， 擦干， 60℃处理2h备用； 处理的 盖玻片平放 六孔板内， 将密度为10 ×104/mL细胞滴加于盖玻片上， 37℃， 50％CO2培养96h； 将 培养好的细胞进行镜下观 察， 并用4℃PBS轻轻洗2遍； 4％多聚甲醛4℃固定10min； 4℃PBS温 柔漂洗3遍， 5min/次； (2)用含0.25％TrixtonX ‑100的PBS作用10min， 透化细胞膜； 4℃PBS温柔漂洗3遍， 5min/次； 5％BSA封闭1h； 室温下直接用10％正常的山羊血清进行封闭， 按1： 100的比例加入 兔抗人的p ‑HER2抗体， 置湿盒4℃孵 育过夜； (3)第二天取出复温20min， 4℃PBS温柔冲洗3遍， 洗净一抗； 加入荧光二抗， 37℃与羊抗 兔二抗和羊抗小鼠二抗联合孵育1h， 50～100 μL/孔， 室温孵育2h； 4℃PBS温柔冲洗3遍， 洗净 二抗； 细胞核用显核剂染色， 在免疫荧 光显微镜下采集图像， 并用Ima geJ计算平均光密度。 6.如权利要求5所述验证马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90表达 的干预作用的方法， 其特 征在于， 步骤(1)中， 培 养过程中， 细胞培 养24h换细胞生长维持液。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114432386 A 27.如权利要求2所述验证马归液对内毒素致膀胱上皮细胞中HER2磷酸化及HSP90表达 的干预作用的方法， 其特征在于， 步骤三中， 所述Western  Blotting方法检测p ‑HER2在CRL ‑ 9520细胞中表达， 包括： (1)蛋白样品制备 单层贴壁细 胞核蛋白的提取： ①选择长满单层的， 无污染的CRL ‑9520细胞， 吸弃去培养 液， 将细胞瓶倒扣在吸水纸上， 吸干培养液； ②每瓶细胞加2mL预冷的PBS  1min弃去PBS液， 反复3次； ③加蛋白酶抑制剂， 磷酸酶抑制剂各100μL/孔作用10min后， 冰上加RIPA裂解液 0.5mL， 细胞培养瓶置冰上， 加 入400 μL裂解液， 冰上30min， 来回摇动细胞瓶， 使细胞充分裂 解；④无菌细胞刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧， 超声裂解细胞； ⑤4℃16000g离心5 min， 取上 清‑80℃保存备用； BCA法检测样品蛋白浓度： ①称取0.5g牛血清白蛋白， 溶于蒸馏水中并定容至100ml， 制 成5mg/ml的溶液； 用时稀释 十倍；②绘制标准曲线： 取96孔 酶标板， 加入试剂； ③吸取20 μl样 品溶液于酶标板孔中， 加入BCA试剂200 μl， 轻摇， 37℃50min， 室温10min， 以空白为对照， 在 酶标仪562nm处测定吸光值OD， 以牛血清白蛋白含量为横坐标， 以吸光值为纵坐标， 绘制标 准曲线； 以标准曲线空白为对照， 根据样品的吸光 值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量； 以BSA各级工作液对应的蛋白质浓度蛋白质浓度Y， mg/mL， 对OD值x作图； Y＝0.32.36X ‑ 0.07， 相关系数r＝0.964； (2)SDS‑‑PAGE电泳 ①灌胶与上样： 玻璃板对齐后放入夹中卡紧， 垂直卡在架子上准备灌胶； 制10％分离 胶： 称取一定量的琼脂糖于三角瓶中， 加入1xTBE液， 微波炉加热3min， 使琼脂糖完全溶解， 待溶解的琼脂糖温度下降至60℃时， 加 入终浓度0.1pg/ml的GeneFin der液， 充分混匀后倒 板， 待凝固， 小心移去梳子， 将凝胶板置入电泳槽， 向电泳槽中倒入1xTBE， 使之没过胶面 2mm； 配好的10％分离胶加 入TEMED后立即摇匀， 灌胶； 配8％的浓缩胶， 加 入TEMED后立即摇 匀灌胶， 剩余空间灌满浓缩胶后， 将梳子水平插入浓缩胶中； 待到浓缩胶凝固后， 两手分别 捏住梳子的两边垂直向上 轻慢将其 拔出； 用无离 子水冲洗浓 缩胶， 将其 放入电泳 槽中； 测完蛋白含量后， 计算出20μL蛋白的溶液体积作为上样量； 吸取样品至200μL的EP管 中， 加入5xSDS上样缓冲液至终浓度为l ×； 上样前将样品于沸水中煮5min使蛋白变性； 加足 够的电泳液后， 即电泳液漫过内测的小玻璃板， 用微量进样 器挨壁吸取样品， 将加样 器针头 插至加样孔中缓慢加入样品； ②电泳： 浓缩胶时用60V跑， 到分离胶以后用120V跑， 电泳时间2h； 电泳至溴酚兰刚跑出 即可终止电泳， 进行转膜； ③转膜： 准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜； 切好 的硝酸纤 维素膜用镊子捏住一边轻轻置于有超纯水的平皿里， 使膜浮于水上浸1h； 在加有转移液 的 盘里放入转膜用的夹子、 两块海绵垫、 一支玻棒、 滤纸和浸过的膜； 用夹子打开使黑的一面 保持水平； 在上面垫一张海绵垫， 用玻棒来回擀走里面的气泡； 再垫上垫三层滤纸， 一手固 定滤纸一手持玻棒擀去气泡； 将玻璃板轻柔撬掉剥胶， 除去小玻璃板后， 将浓缩胶切去， 小 心剥下分离胶盖于滤纸上， 使其与