(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111677244.X (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 苏州大学 地址 215000 江苏省苏州市姑苏区十 梓街1 号 (72)发明人 郑毅然　陈星烨　 (74)专利代理 机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 3210 3 专利代理师 范晴　郑好 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C07K 16/24(2006.01) C07K 1/107(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01)C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 39/44(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 工程化免疫细胞、 纳米凝胶及其制备方法和 应用 (57)摘要 本发明公开了工程化免疫细胞、 纳米凝胶及 其制备方法和应用， 该制备方法将PD ‑1单抗与氧 化还原响应的连接剂交联合 成纳米凝胶， 对其表 面进行二苯并环辛炔修饰， 接着与叠氮化物标记 的T细胞通过点击化学反应相结合， 使 NG锚点在T 细胞表面。 PD ‑1单抗与ACT  T细胞的时空共存以 及T细胞活化引发的药物释放可以显著增加TME 中PD‑1单抗的有效剂量。 在小鼠皮下 实体瘤模型 中， 锚定在细胞表面的PD ‑1单抗和T细胞联合抑 制了96％的肿瘤生长 。 权利要求书1页 说明书14页 附图7页 CN 114478772 A 2022.05.13 CN 114478772 A 1.一种纳米凝胶的制备 方法， 其特 征是， 包括如下步骤： 1)、 配置连接剂溶 液； 2)、 向单抗溶 液中加入步骤1)所述的连接剂溶 液进行混合反应， 得到纳米凝胶。 2.权利要求1所述的纳米凝胶的制备方法， 其特征是， 所述单抗包括PD ‑1单抗、 CTLA ‑4 单抗、 TNFα 单抗。 3.权利要求2所述的纳米凝胶的制备方法， 其特征是， 所述连接剂包括DTSSP或两端带 有能够与抗体反应的化学 官能团的分子 。 4.权利要求1所述的纳米凝胶的制备方法， 其特征是， 所述单抗和所述连接剂的摩尔比 为(1： 25～1： 20 0)； 反应时间为1～ 2小时。 5.权利要求1～4任一项所述的纳米凝胶的制备方法， 其特征是， 还包括步骤3)， 向步骤 2)得到的纳米凝胶中加入DBCO ‑PEG‑NHS溶液， 并在摇床上进行反应， 得到DBCO ‑aPD1‑NGs。 6.权利要求1～4任一项所述的纳米凝胶的制备方法， 其特征是， 还包括步骤3)， 向步骤 2)得到的纳米凝胶中加入D SPE‑PEG‑NHS溶液， 并在摇床上进行反应， 得到D SPE‑aPD1‑NGs。 7.权利要求1～6任一项所述的纳米凝胶的制备 方法所制备的纳米凝胶。 8.一种工程化免疫细胞， 其特征是， 使权利要求5所述的DBCO ‑aPD1‑NGs与叠氮化物标 记的工程 化免疫细胞通过点击化学反应相结合， 使纳米凝胶锚点在工程 化免疫细胞表面。 9.权利要求8所述的工程化免疫细胞， 其特征是， 所述工程化免疫细胞由以下方法制备 而成： 1)、 配置D SPE‑PEG‑N3溶液； 2)、 向工程化免疫细胞重悬液加入至步骤1)所述的DSPE ‑PEG‑N3溶液中进行混合反应， 得到表面连有D SPE‑PEG‑N3的工程 化免疫细胞； 3)、 将表面连有DSPE ‑PEG‑N3的工程化免疫细 胞重悬于培养基中， 同时向培养基中加入 所述DBCO ‑aPD1‑NGs进行孵育， 待孵育结束后， 收集表面结合有DBCO ‑aPD1‑NGs的工程化免 疫细胞。 10.一种工程化免疫细 胞， 其特征是， 使权利 要求6所述的DSPE ‑aPD1‑NGs与工程化免疫 细胞共孵 育相结合， 使纳米凝胶锚点在工程 化免疫细胞表面。 11.权利要求10所述的工程化免疫细胞， 其特征是， 所述工程化免疫细胞由以下方法制 备而成： 1)、 工程化免疫细胞重悬在培 养基中； 2)、 向步骤1)的培养基中加入所述 的DSPE‑aPD1‑NGs进行孵育， 待孵育结束后， 收集表 面结合有D SPE‑aPD1‑NGs的工程化免疫细胞。 12.权利要求8～11中任一项所述的工程化免疫细胞， 其特征是， 所述工程化免疫细胞 包括T细胞、 NK细胞或巨噬细胞。 13.抑制剂， 其特 征是， 包括权利要求8～12中任一项所述的工程 化免疫细胞。 14.药物组合物， 其特征是， 包括权利要求8～12中任一项所述的工程化免疫细胞和和 药学上可接受的辅料。 15.权利要求8～12中任一项所述的工程化免疫细胞、 权利要求13所述的抑制剂以及权 利要求14所述的药物组合物在使用T细胞 受体T细胞或嵌合抗原受体T细胞的过继细胞疗法 中的应用， 以抑制实体瘤的生长 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114478772 A 2工程化免疫细胞、 纳米凝胶及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及工程 化免疫细胞、 纳米凝胶 及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]从活体组织中分离出的肿瘤浸润T细胞或是基因改造后的患者外周血淋巴细胞能 分别通过T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)特异性识别肿瘤抗原。 在过继细胞疗法 (ACT)中， 这些肿瘤特异性细胞在体外激活、 增殖后被回输至患者体内， 对癌细胞进行杀伤。 目前， 以CAR ‑T疗法为代表的ACT在某些血液癌症患者中取得了喜人的临床疗效， 但其对实 体瘤的疗效依旧不尽如人意。 其中， 免疫抑制的肿 瘤微环境(TME)是ACT治疗实体瘤的主要 挑战之一。 [0003]在TME中， 肿瘤细胞利用各种机制如分泌可溶性抑制因子或直接物理接触来抑制T 细胞的功能。 最有效的方法之一是上调肿瘤细胞自身程序性细胞死亡配体1(PD ‑L1)的表 达。 PD‑L1与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所表达的程序性细胞死亡受体1(PD ‑1)结合， 从而 “劫 持”免疫检查点通路， 抑制T细胞的抗肿瘤功能。 免疫检查点抑制剂可以逆转来自肿瘤细胞 的免疫抑制， 从而提高外源性ACT细胞和内源性肿瘤特异性CTL的治疗效果。 [0004]针对PD‑1或PD‑L1的单克隆抗体(aPD1和aPDL1)目前正被广泛地运用在临床研究 中， 以期增强 内源性CTL的功能。 虽然免疫检查点抑制剂在一部 分病人中取得了持久的抗肿 瘤效果， 但患者对ICI的整体反应率较低， 患者的总体生存率仍然不高。 对于外源性ACT  T细 胞而言， 尽管免疫检查点抑制剂可以有效延长其功能， 但是临床治疗效果一般。 此外， 大剂 量或长时间使用免疫检查点抑制剂可能导致全身性毒副反应， 引起胃肠道、 内分泌腺、 皮肤 和肝脏等器官系统的严重不良反应。 一些患者甚至在长期用药后对免疫检查点抑制剂产生 耐药性或并发自身免疫性疾病。 [0005]有研究尝试通过基因工程使CAR ‑T细胞自分泌免疫检查点抑制剂， 或将T细胞PD ‑1 受体的胞内抑制域替换为增殖增强域， 来提高CAR ‑T细胞的治疗效果。 然而， CAR ‑T细胞可能 会在患者体内不受控制的增殖， 产生 安全隐患。 [0006]生物材料已被用于增加TME中免疫检查点抑制剂的局部浓度， 提高治疗效果， 同时 减少非肿瘤部位的不良副作用。 以PD ‑1单抗为代表的免疫检查点抑制剂可以通过不同的递 送平台， 以“货物”的形式运送到TME或肿瘤附近。 此外， 免疫检查点抑制剂还可以充当配体 用于增强纳米粒的靶向性， 作为运载工具的重要 元件或作为联合治疗的组成部分。 然而， 这 些方法主要是增强内源性T细胞的功能而不是提高ACT  T细胞的抗肿瘤功效。 此外， 免疫检 查点抑制剂从这些递送平台中释放出来的机制和ACT  T细胞的激活和功能没有关联性， 不 能在T细胞最需要药物 支持的时间和部位发挥作用。 [0007]最近， 利用T细胞作为药物载体引起了人们的兴趣。 当ACT  T细胞浸润到肿瘤组织 中时， 偶联在 T细胞表面的纳米颗粒也可以进入TME。 这种方法使辅助药物可以和ACT  T细胞 时空共存， 增加药物的有效剂量并增强T细胞的抗肿瘤功能。 免疫调节药物如细胞 因子白介 素15和小分子药物已被偶联到T细胞表面， 并在临床前研究中改善 了疗效。说　明　书 1/14 页 3 CN 114478772 A 3