饲料中庆大霉素的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of gentamycin in feeds— Liquid chromatography-tandem mass spectrometry    ICS  65.120 CCS  B 46   中华人民共和国国家标准 GB/T 44617—2024 2024-09-2 9发布 2025-04-0 1实施     国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发 布前　　言 本文件按照GB/T 1.1－2020《标准化工作导则　第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、四川威尔检测技术股份有限公 司、北京工商大学、通威农业发展有限公司。 本文件主要起草人：索德成、郑玲燕、张凤枰、樊霞、陈刚、安志新、张璐、冯玉超、肖志明、 王石、吴金玉、董鹏、张航俊、姚婷、唐建。   GB/T 44617—2024     Ⅰ 饲料中庆大霉素的测定 液相色谱-串联质谱法 1　范围   本文件描述了用液相色谱﹘串联质谱法测定饲料中庆大霉素的原理、试剂或材料、仪器设备、样 品、试验步骤、试验数据处理。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中庆大霉素（以庆大霉素C1、 庆大霉素C1a、庆大霉素C2和庆大霉素C2a之和计）的测定。 本文件庆大霉素的检出限为0.030 mg/kg，定量限为0.100 mg/kg。 2　规范性引用文件   下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。  GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　术语和定义   本文件没有需要界定的术语和定义。 4　原理   试样中的庆大霉素用5%三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，用液相色谱﹘串 联质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。 5　试剂或材料   除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1　水：GB/T 6682，一级。 5.2　甲酸铵：色谱纯。 5.3　甲酸：色谱纯。 5.4　甲醇：色谱纯。 5.5　乙腈：色谱纯。 5.6　0.1%甲酸溶液：取1.0 mL甲酸（5.3）, 用水稀释至1 000 mL，混匀。 5.7　0.1%甲酸乙腈溶液：取1.0 mL甲酸（5.3），用乙腈稀释至1 000 mL，混匀。 5.8　10%氨水甲醇溶液：取氨水10 mL，用甲醇（5.4）稀释至100 mL，混匀。 5.9　1%七氟丁酸酐甲酸溶液：取七氟丁酸酐0.5 mL，用0.1%甲酸溶液（5.6）稀释至50 mL，混匀。 临用现配。 GB/T 44617—2024     1 5.10　2 mol/L甲酸铵溶液：称取甲酸铵（5.2）12.6 g，用水溶解并稀释至1 000 mL，混匀。 5.11　甲酸铵﹘甲酸溶液：取2 mol/L甲酸铵溶液（5.10）1 mL、甲酸（5.3）1 mL，用水稀释至 1 000 mL，混匀。 5.12　5%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸5 g、乙二胺四乙酸二钠0.15 g，加水溶解并稀释至100 mL， 混匀。 5.13　硫酸庆大霉素（Gentamicin sulfate，CAS 号：1405﹘41﹘0）标准品：参考《中华人民共和国药 典》关于硫酸庆大霉素规定要求。参考标准品数值如下：纯度89.8%±5.0%。其中C1组分含量为 29.5%，C1a组分含量为19.8%，C2与C2a组分含量为50.7%。不同生产厂家的标准品各组分含量可能 不同。也可以采用相应单组分标准品。 5.14　庆大霉素标准储备溶液（以四种庆大霉素组分之和计，100 μg/mL）：称取硫酸庆大霉素标准品 适量（精确至0.01 mg），用水溶解，转移至100 mL容量瓶，定容，混匀，配制成100 μg/mL的庆大霉 素标准溶液（其中庆大霉素C1组分为29.5 μg/mL，庆大霉素C1a组分为19.8 μg/mL，庆大霉素 C2+C2a组分为50.7 μg/mL）。－18 ℃以下贮存，有效期6个月。或采用标准物质/标准样品。 5.15　庆大霉素标准中间溶液（10 μg/mL）：准确移取标准储备溶液（5.14）10 mL，用水稀释、定容 至100 mL，混匀。临用现配。 5.16　庆大霉素标准系列溶液：准确移取标准中间溶液（5.15）适量，用1%七氟丁酸酐甲酸溶液 （5.9）稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、 200 ng/mL、500 ng/mL（其中庆大霉素C1组分为1.475 ng/mL、2.95 ng/mL、14.75 ng/mL、 29.5 ng/mL、59.0 ng/mL、147.5 ng/mL；庆大霉素C1a组分为0.99 ng/mL、1.98 ng/mL、 9.90 ng/mL、19.0 ng/mL、39.6 ng/mL、99 ng/mL；庆大霉素C2+C2a组分为2.535 ng/mL、 5.07 ng/mL、25.35 ng/mL、50.7 ng/mL、101.4 ng/mL、253.5 ng/mL）的标准工作液，置4℃冰箱 中避光保存。现用现配。 5.17　混合型阳离子交换固相萃取小柱：以苯磺酸化的聚苯乙烯﹘二乙烯基苯高聚物为填料，60 mg/ 3 mL，或性能相当者。 5.18　微孔滤膜：0.22 μm，有机系。 6　仪器设备   6.1　液相色谱﹘串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。 6.2　分析天平：精度分别为0.1 mg和0.01 mg。 6.3　离心机：转速不低于8 000 r/min。 6.4　超声波清洗仪。 6.5　固相萃取装置。 6.6　氮吹仪。 7　样品   按照 GB/T 20195规定制备试样，至少200 g配合饲料、浓缩饲料和精料补充料粉碎使其全部过 0.425 mm试验筛，充分均匀；添加剂预混合饲料无须粉碎，混合均匀，装入密闭容器中，备用。选取类 型相同、均匀一致， 且在待测物保留时间处其仪器响应值小于方法定量限相应值30%的饲料样品，作 为空白样品。       GB/T 44617—2024     2 8　试验步骤  8.1　提取   平行做两份试验。称取试样5 g（精确至0. 1 mg），置于50 mL离心管中，加入20 mL 5%三氯乙 酸溶液（5.12），超声提取30 min，每10 min振摇一次，8 000 r/min离心5 min。取上清液作为试样提取 溶液，备用。 8.2　净化   依次用3 mL甲醇和3 mL水活化混合型阳离子交换固相萃取小柱（5.17），准确移取5 mL备用液上柱，分别用3 mL水和 3 mL甲醇淋洗，负压抽干，用3 mL 10%氨水甲醇溶液（5.8）洗脱，收集洗脱液于40 ℃下用氮气吹至近 干，准确加入1 mL 1%七氟丁酸酐甲酸溶液（5.9），涡旋溶解，过微孔滤膜（5.18），滤液待测。 8.3　基质匹配标准系列溶液的制备   取空白试样，按8.1和8.2处理至“于40 ℃下用氮气吹至近干”，得到试样空白基质。准确移取标 准系列溶液（5.16）各1 mL分别加入吹至近干的空白基质中，涡旋混匀，制得质量浓度分别为 5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的基质匹配标准系列溶液 （其中庆大霉素C1组分为1.475 ng/mL、2.95 ng/mL、14.75 ng/mL、29.5 ng/mL、59.0 ng/mL、 147.5 ng/mL；庆大霉素C1a组分为0.99 ng/mL、1.98 ng/mL、9.90 ng/mL、19.0 ng/mL、 39.6 ng/mL、99 ng/mL；庆大霉素C2+C2a组分为2.535 ng/mL、5.07 ng/mL、25.35 ng/mL、 50.7 ng/mL、101.4 ng/mL、253.5 ng/mL）。过微孔滤膜（5.18），滤液待测。 8.4　测定  8.4.1　液相色谱参考条件   液相色谱参考条件如下： 色谱柱：C18色谱柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径1.7 μm，或性能相当者； a） 柱温：30 ℃； b） 流速：0.4 mL/min； c） 进样量：5 μL； d） 流动相：A相为甲酸铵﹘甲酸溶液（5.11），B相为0.1%甲酸乙腈溶液（5.7），梯度洗脱程序见 表1。e） 表1　梯度洗脱程序   时间/min A相/% B相/% 0 90 10 1.0 90 10 4.0 70 30 4.1 5 95 5.0 5 95 5.1 90 10 8 90 10 GB/T 44617—2024     3 8.4.2　质谱参考条件   质谱参考条件如下： 电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）； a） 检测方式：多反应监测（MRM）； b） 雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气或其他合适气体； c） 碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度。 d） 多反应监测（MRM）定性离子对、定量离子对、解离电压及碰撞能量见表2。 表2　多反应监测（MRM）离子对、碰撞能量参考值   待测物名称