ICS67.120 CCSB51 中华人民共和国国家标准 GB/T44742—2024 海参及其制品中海参多糖的测定 高效液相色谱法 Determinationofseacucumberpolysaccharidesinseacucumberand itsproducts—Highperformanceliquidchromatography 2024-10-26发布 2025-05-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 本文件起草单位:中国海洋大学、中国标准化研究院、山东好当家海洋发展股份有限公司、大连晓芹 食品有限公司、青岛海洋食品营养与健康创新研究院、泉州海洋生物产业研究院、通标标准技术服务有 限公司大连分公司、中山洪力健康食品产业研究院有限公司。 本文件主要起草人:薛长湖、樊燕、王玉明、毛相朝、侯虎、席兴军、胡炜、梁卫刚、孙永军、李超、何春丽、 冯婷玉、李若姝、刘守峰、栾稳稳、雷敏芝。 ⅠGB/T44742—2024 海参及其制品中海参多糖的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件描述了海参及其制品中海参多糖含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于海参及海参粉中海参多糖的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 海参多糖 seacucumberpolysaccharides 一类由海参岩藻聚糖硫酸酯和海参硫酸软骨素组成的多糖。 注:海参岩藻聚糖硫酸酯是一类由L-岩藻糖聚合形成的直链硫酸化多糖;海参硫酸软骨素是一类具有岩藻糖支链 取代的硫酸酯化多糖,主要由D-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-岩藻糖构成。 4 原理 样品经酶解、乙酸钾沉淀、酸解后制备得到海参多糖水解液,水解液中岩藻糖与1-苯基-3-甲基-5-吡 唑啉酮(PMP)进行衍生反应,产物经C18色谱柱分离,经配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定,内标 法定量(乳糖为内标物),以岩藻糖含量标识样品中海参多糖的含量。 5 试剂和材料 5.1 试剂 5.1.1 水:GB/T6682,一级。 5.1.2 木瓜蛋白酶:食品级,酶活力≥10.00万U/g。 5.1.3 乙二胺四乙酸(C10H16N2O8)。 5.1.4 半胱氨酸盐酸盐(H-Cys-OHHCl)。 5.1.5 乙酸钾(CH3COOK)。 5.1.6 三氯甲烷(CHCl3)。 1GB/T44742—2024 5.2 试剂配制 5.2.1 0.10mol/L乙酸钠缓冲液:准确称取8.20g无水乙酸钠,用水溶解,用冰乙酸调节pH至5.90~ 6.10并定容至1000.00mL。 5.2.2 2.00mol/L三氟乙酸溶液:准确移取14.85mL三氟乙酸,用水稀释至100.00mL。 5.2.3 0.30mol/L氢氧化钠溶液:准确称取1.20g氢氧化钠,用水溶解并稀释至100.00mL。 5.2.4 0.30mol/L盐酸溶液:准确移取2.50mL盐酸,用水稀释至100.00mL。 5.2.5 0.50mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液:采用热熔解-冷析晶技术,将1-苯基-3-甲基-5- 吡唑啉酮(PMP)于甲醇(色谱纯)中进行重结晶,准确称取174.00mg重结晶的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉 酮,用2.00mL甲醇(色谱纯)溶解。 5.2.6 0.05mol/L磷酸盐缓冲液:准确称取6.80g磷酸二氢钾,用水溶解,用0.30mol/L氢氧化钠溶 液(5.2.3)调节pH至6.80~7.00,并定容至100.00mL。使用前,用0.45μm微孔滤膜(5.5)过滤。 5.2.7 磷酸盐-乙腈溶液1:取乙腈(色谱纯)150.00mL,用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(5.4.4)稀释至 1000.00mL。 5.2.8 磷酸盐-乙腈溶液2:取乙腈(色谱纯)400.00mL,用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(5.4.4)稀释至 1000.00mL。 5.3 标准品与内标物 标准品:L-岩藻糖(Fuc,CAS号:2438-80-4),纯度≥99%。 内标物:乳糖(Lac,CAS号:63-42-3),纯度≥99%。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 岩藻糖标准储备液:准确称取经干燥至恒重的L-岩藻糖(5.3)8.20mg,用水溶解并稀释至 5.00mL。该溶液浓度为10.00mmol/L,4℃密封避光存放,有效期15d。 5.4.2 岩藻糖标准工作液:准确移取适量岩藻糖标准储备液(5.4.1),用水稀释成浓度为0.10mmol/L、 0.25mmol/L、0.50mmol/L、0.75mmol/L、1.00mmol/L、1.25mmol/L的岩藻糖系列标准工作液,现 用现配。 5.4.3 2.00mmol/L乳糖内标工作液:准确称取经干燥至恒重的乳糖(5.3)68.00mg,用水溶解并稀释 至100.00mL。该溶液浓度为2.00mmol/L,4℃密封避光存放,有效期15d。 5.5 材料 微孔滤膜:0.45μm水相。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪:配置紫外检测器。 6.2 分析天平:感量0.01g和0.01mg。 6.3 离心机:离心力不低于8000.00×g。 6.4 电热恒温鼓风干燥箱。 6.5 超声波清洗仪。 6.6 涡旋混合器。 6.7 恒温水浴锅。 6.8 恒温水浴振荡器。 2GB/T44742—2024 6.9 氮吹仪。 6.10 pH计。 6.11 微量移液器。 6.12 小型粉碎机。 7 测定步骤 7.1 样品前处理 鲜海参去肠腺、去灰嘴,剪成不大于0.50cm×0.50cm的小块,70℃烘干12h,恒重后将其粉碎,过 20目筛(筛网孔径0.85mm)混匀备用;干海参粉碎,过20目筛,混匀备用。 7.2 试样中海参硫酸软骨素的提取与水解液的制备 称取1g(精确至0.01g)粉末试样,置于50mL三角瓶中,加入25.00mL0.10mol/L乙酸钠缓冲 液(5.2.1),加入100.00mg木瓜蛋白酶(5.1.2)、37.00mg乙二胺四乙酸(5.1.3)和22.00mg半胱氨酸盐 酸盐(5.1.4),涡旋混合,60℃恒温水浴振荡酶解24h,将酶解液全部转移至50mL离心管中,8000.00×g 离心10min。弃去沉淀,上清液转移至50mL烧杯中,加入6.13g乙酸钾(5.1.5),涡旋混合,超声至乙 酸钾完全溶解。 于4℃静置12h后转移至另一50mL离心管,8000.00×g离心10min,弃去上清液,沉淀用 5.00mL水超声溶解后转移至10mL容量瓶,用水稀释至刻度,即得海参硫酸软骨素溶液。取1.00mL 海参硫酸软骨素溶液于5mL安瓿瓶中,加入1.00mL2.00mol/L三氟乙酸溶液(5.2.2),充氮封管,110℃ 水解8h后,于70℃氮气吹干,加2.00mL水超声溶解残余物,用0.30mol/L氢氧化钠溶液(5.2.3)调 节水解液pH至6.50~7.50后转移入5mL容量瓶,用水稀释至刻度,即得海参硫酸软骨素水解液。 7.3 试样衍生及净化 准确移取7.2制备的海参硫酸软骨素水解液400μL于10mL具塞试管中,加入50μL2.00mmol/L 乳糖内标工作液(5.4.3)、450μL0.50mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液(5.2.5)和450μL 0.30mol/L氢氧化钠溶液(5.2.3),涡旋混合,70℃水浴反应30min,取出冷却至室温,加450μL 0.30mol/L盐酸溶液(5.2.4),涡旋混合,加1.00mL三氯甲烷(5.1.6),充分振荡,静置分层,弃去下层三 氯甲烷层,按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次。将上层水相过0.45μm滤膜,供高效液相色谱分析。 7.4 岩藻糖标准曲线绘制 分别准确移取浓度为0.10mmol/L、0.25mmol/L、0.50mmol/L、0.75mmol/L、1.00mmol/L、 1.25mmol/L的岩藻糖标准工作液(5.4.2)400μL于6个10mL具塞试管中,分别加入50μL 2.00mmol/L乳糖溶液(5.4.3)、450μL0.50mmol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液(5.2.5)和 450μL0.30mol/L氢氧化钠溶液(5.2.3),涡旋混合均匀后,70℃水浴反应30min,然后按7.3中所述 方法进行酸化和净化操作,制备岩藻糖系列标准溶液衍生物。以岩藻糖衍生物的峰面积与乳糖峰衍生 物的峰面积之比为纵坐标,以相应的岩藻糖浓度为横坐标绘制标准工作曲线。 7.5 测定 7.5.1 色谱参考条件 7.5.1.1 色谱柱:C18(250mm×4.6mm,粒径5μm),或性能相当者。 7.5.1.2 流动相:A:磷酸盐-乙腈溶液1(5.2.7),B:磷酸盐-乙腈溶液2(5.2.8);梯度洗脱程序见表1。 3GB/T44742—2024 7.5.1.3 流速:1.00mL/min。 7.5.1.4 柱温:25℃。 7.5.1.5 检测波长:254nm。 7.5